Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir.
Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir.
Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını
filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.
Maddenin ışığı absorplamasını incelemek için kullanılan düzeneğe absorpsiyon spektrometresi veya absorpsiyon spektrofotometresi adı verilir.
Bir spektrofotometre düzeneği, başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi (monokromatör), dedektörden oluşur; dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür.
Ana bileşenlere ek olarak spektrofotometrede ışığı toplamak, odaklamak, yansıtmak, iki demete bölmek, ve örnek üzerine belli bir şiddette göndermek amacıyla mercekler, aynalar, ışık bölücüleri, giriş ve çıkış aralıkları vardır. Örnek, kullanılan dalga boyu bölgesinde ışığı geçiren maddeden yapılmış örnek kaplarına (küvet) konularak ışık yoluna yerleştirilir.
UV Işın Kaynakları
UV-görünür bölgede D2, W, H2, Xe, civa buhar lambası gibi sürekli ışık kaynakları kullanılır.
Tungsten flaman lambası, görünür ve yakın IR bölgede (320-3000 nm) ışık yayar. Tungsten lambasının içinde bir miktar iyot veya brom buharı bulunursa lambanın ömrü artar ve bu lamba tungsten- halojen lambası olarak adlandırılır.
Ulraviyole bölgede en çok kullanılan lambalar, hidrojen ve döteryum elektriksel boşalım lambalarıdır. Bu lambalar 180-380 nm arasında ışık yayar. Daha pahalı ve daha uzun ömürlü olan D2 lambasının yaydığı ışığın şiddeti H2 lambasına göre çok daha fazladır.
Xe ark lambası, UV-görünür bölgenin tümünde (150-700 nm)
kullanılabilecek şiddetli ve sürekli ışık kaynağıdır.
Civa buhar lambası, her iki bölgede ışıma yapabilen bir ışık
kaynağıdır; sürekli spektruma ek olarak kesikli hatlar da içerir.
Dalga boyu seçicileri (monokromatörler)
Işık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir.
Monokromatör, filtreli fotometrelerde ışık filtresidir; spektrofotometrelerde ise ışık prizmasıdır.
Örnek üzerine gönderilen ışığın daha monokromatik
olmasını sağlamak için bazı spektrofotometrelerde çift monokromatör kullanılır.
Işık filtreleri
Camdan yapılmış ve uygun boyalarla boyanmış filtrelerdir. Portatif olup kullanıcı istediği zaman uygun dalga boyundaki filtreyi cihaza takar. Filtrelerin üzerinde geçirdikleri dalga boyu yazılıdır. Filtrenin rengi, ölçüm yapılacak çözeltinin rengine göre seçilir; örneğin, mavi ışığı tutan (sarı) bir maddenin ölçümünde sadece mavi ışığı geçiren filtre kullanılır.
Işık prizmaları
Cam veya kuartz olabilir. Özellikle düşük UV ışınları iyi geçirmediğinden cam prizma görünür bölge için uygundur. Kuartz prizmalar ise hem UV ışınlarını iyi geçirir, hem de görünür ışık ve IR’e yakın bölgelerde çalışmaya elverişlidir. Kuartz prizmalar pahalı spektrofotometrelerde bulunur.
Spektrofotometrelerde dedektör
Maddenin ışığı absorplayıp absorplamadığını anlamak için ışık kaynağından gelen ışığın şiddetinin ölçülmesi amacıyla kullanılan düzenektir. UV-görünür bölgede kullanılabilen üç tür dedektör vardır.
Fotovoltaik dedektörler
Fototüp
Fotoçoğaltıcı tüp
Tek ışık yollu spektrofotometrelerde, bileşenlerin tümü aynı ışık yoluna yerleştirilmiştir.
Bu aletin başlıca üç ayar düğmesi vardır: Bunlardan biri, alette kullanılan optik ağ veya prizmayı mekanik olarak döndürmeyi sağlayan düğmedir. İkinci düğme, ışık yolunu tamamen kapatarak galvanometre “sıfır” geçirgenlik ayarını yapmak içindir. Üçüncü düğme, ışığın geçtiği aralığın enini değiştirir.
Ölçümün yapılacağı dalga boyu birinci düğme ile ayarlandıktan sonra ışık yolu kapatılarak ikinci düğme ile “sıfır” ayarı yapılır. Daha sonra üçüncü düğme ile ışığın geçtiği aralığın eni değiştirilerek ve örnek kabında sadece çözücü kullanılarak
galvanometre 100 değerine getirilir. Sıfır ve 100 ayarları her dalga
boyunda yeniden yapılmalıdır.
Çift ışık yollu spektrofotometrelerde, monokromatörden çıkan ışık, eşit şiddette iki demete bölünerek biri örneğe diğeri sadece çözücünün bulunduğu kaba gönderilir. İkiye ayrılan ışık, iki ayrı dedektörle algılanır ve dedektörlerde oluşan sinyallerin oranı ölçülür. Böylece örnekteki geçirgenlik değeri sürekli olarak çözücününki ile karşılaştırılmış olur. Burada iki dedektörün tam uyumlu olması, yani eşit şiddetteki ışık ile aynı sinyali oluşturması gerekir.
Çift ışık yollu spektrofotometrelerde, tek dedektör kullanılarak da ölçüm yapmak mümkündür.
Örnekten ve çözücüden geçen ışık demetleri dedektör üzerine art arda gelir ve alternatif türden sinyal oluşturur. Işık şiddetleri eşit ise dedektörde herhangi bir sinyal oluşmaz; örnek bölmesinden gelen ışığın şiddeti absorpsiyon nedeniyle azaldığı zaman dedektöre gelen sinyal alternatif sinyal olarak algılanır.
Çift ışık yollu spektrofotometrelerin bir başka türü çift dalga boylu spektrofotometrelerdir. Çift dalga boylu spektrofotometrelerde iki farklı monokromatör vardır; iki farklı dalga boyundaki ışık, dönen bir ışık bölücü yardımıyla örnekle art arda etkileştirilir.
Bulanık çözeltilerde dalga boylarından biri çözeltideki maddenin absorplayacağı, diğeri ise absorplamayacağı değerlere ayarlanır. Bulanıklıktan dolayı her iki dalga boyunda aynı miktarda ışık kaybı olacağından iki dalga boyunda yapılan ölçümlerin farkı, sadece örneğin
absorbansı ile ilişkilidir.
Kalibrasyon Grafiği
Spektrofotometre ile bir maddenin nicel analizinin yapılacağı dalga boyunu kararlaştırmak için, örneğin absorpsiyon spektrumunu bilmek gerekir. Bunun için, maddenin 1 molar çözeltisinin çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür.
Çözücünün ve çözeltide bulunan başka türlerin ışığı absorplamadığı, Lambert- Beer eşitliğine uyulduğu ve nicel analizin en duyarlı bir biçimde yapılabileceği dalga boyu değeri saptandıktan sonra analizi yapılacak maddeyi içeren ve derişimleri bilinen bir dizi standart çözelti ile bu dalga boyundaki absorbans (A) değerleri ölçülür. A değerleri, standart çözeltilerin bilinen derişimlerine karşı grafiğe geçirilir.
Standart çözeltilerin bilinen derişimlerine karşı A değerlerini grafiğe geçirmek suretiyle elde edilen doğruya kalibrasyon doğrusu denir.
Nicel analiz, kalibrasyon doğrusunun doğrusal olduğu bölgede yapılır. Derişimi bilinmeyen örneğin A değeri ölçülür ve kalibrasyon doğrusunda bu değere karşılık gelen derişim saptanır.
Molar absorpsiyon katsayısının değerinin bilindiği durumlarda, Lambert-Beer eşitliğinin analizde doğrudan
kullanılması da mümkündür.
Absorbans (A)=ε * c * l
Spektrofotometrelerde örneğin konulduğu örnek kapları (küvet), yuvarlak bir tüp veya dört köşe olabilir.
Küvetler, soft veya borosilikat camdan, kuartz veya plastikten yapılır.
Soft camlar asidik çözeltiler, borosilikat camlar kuvvetli alkali çözeltiler için uygundur. Corex gibi bazı camlar 340 nm’de kullanılabilse de kısa UV dalgalar için uygun değildir.
Kuartz küvetler hem UV hem görünür dalga boyları için uygundur.
Plastik küvetler özel üretilmiş ise 200-700 nm arasında rahatlıkla kullanılabilir.
Küvetlerin temizliği:
-Küvetler kullanıldıktan hemen sonra bol çeşme suyu ve ardından distile sudan geçirilmelidir.
-Aşırı kirlenen veya koyu renkli reaktiflerin okunduğu küvetler yumuşak deterjanlı su, çeşme suyu ve distile su ile yıkanmalıdır. Kesinlikle fırça kullanmamalıdır.
-Deterjanla temizlenemeyen küvetler, %20’lik nitrik asitte bir gece bekletildikten sonra, distile sudan geçirilip kullanılır.
-Küvet temizliğinde bikromat solüsyonu kullanılmamalıdır. %10’luk NaOH kullanılabilir; ancak küvetler bu çözeltide uzun süre kalmamalıdır.
Spektrofotometrik ölçümlerde kör, standart ve numune olmak üzere üç tüp hazırlanır.
Kör, cihazın optik ayarlarının (sıfır ve 100 ayarı) yapılması amacıyla kullanılan çözeltidir. Kör çözeltisi olarak distile su veya reaktifin kendisi kullanılır. Bazı ölçümlerde numune körü de kullanılabilir.
Distile su körü, en sık kullanılan kördür; okuma küvetine distile su konularak hazırlanır. Daima absorbans değerinin sıfırlanması için kullanılır.
Reaktif körü, deneyde kullanılan reaktif ile hazırlanan kördür. Deneyde birden fazla reaktif varsa birden fazla reaktif körü de olabilir. Bazen absorbans değerinin sıfırlanması için, bazen de distile su körüne karşı numune gibi kullanılır.
Numune körü, deneyde kullanılan reaktif/numune oranına uygun olarak distile su veya serum fizyolojik ile numune karıştırılarak hazırlanır. Daima distile su veya reaktif körüyle sıfırlanmış cihazda numune gibi okutulur.
Numune gibi okutulan reaktif veya numune körü değerleri numune değerinden çıkarılır.
Standart, aranan maddenin bilinen konsantrasyondaki çözeltisidir.
Numune, içindeki madde miktarını tayin etmek istediğimiz çözeltidir.
Fotometrik ölçümler, esas olarak iki tipte yapılır. Bunlar, end point ve kinetik okumadır.
End point okumada fotometrik okuma, reaksiyon tamamlandıktan sonra yapılır. Bunun için reaksiyon karışımı belli bir süre ve belli bir sıcaklıkta inkübe edilir. Reaksiyon tamamlanıp ürünlerin oluşumu ve dolayısıyla renk oluşumu tamamlandıktan sonra okuma yapılır.
Aö = ε * cö * l
Astd = ε * cstd * l
cö = (Aö/ Astd) * cstd
cö = (cstd/ Astd) * Aö
cö = (Faktör) * Aö
Kinetik okumada birim zamandaki absorbans değişimi ölçülür. Genellikle enzimlerin katalitik aktivitelerinin tayininde kullanılır. Hesaplama için deney ortamındaki kromojen maddenin molar absorpsiyon katsayısının bilinmesi gerekir.
Analiz tüpüne reaktif ve numune konup belirtilen sıcaklıkta inkübasyona bırakılır. Deney metodunda belirtilen bir süre sonra ilk absorbans değerleri okunur. Daha sonra birer dakika aralarla 2, 3 defa daha absorbans değerleri okunur ve birbirini takip eden her iki okumanın
farkı alınır (ΔA). Daha sonra bu dakikalık absorbans farkları toplanıp okuma aralığı sayısına bölünerek
dakikadaki ortalama absorbans değişimi (ΔA/dakika)
bulunur.
Dakikadaki ortalama absorbans değişimi (ΔA/dakika), deneyde ölçülen maddenin miktarı reaksiyon sırasında
artıyorsa (+), azalıyorsa (-) bir sayıdır; hesaplamada mutlak değer alınır.
Eğer reaktifte deney şartlarında numune olmaksızın bir absorbans değişimi oluyorsa bunun tespit edilip numune için bulunan değerden çıkarılması gerekir. Ayrıca ΔA
değerlerinin birbirinden çok farklı olması reaksiyonun lineer olmadığını gösterir.
Kinetik okumada sonuçlar, ΔA/dakika değerleri bir faktörle çarpılarak bulunur.
IU/L (μmol/dak/L) olarak enzim aktivitesi hesaplamasında kullanılan faktör (F):
F = Total volüm x 106 / ε x ışık yolu x numune volümü
Total volüm → ml cinsinden deney tüpündeki toplam sıvı miktarı
106 → sonucu μmol/dak/L = IU/L’ye çevirme katsayısı
ε → L/mol/cm cinsinden molar absorpsiyon katsayısı
(ekstinsiyon katsayısı)
Işık yolu → cm cinsinden okuma küvetinin çapı
Numune volümü → ml cinsinden reaksiyona katılan numune hacmi
Tercih edilen spektrofotometrik ölçüm cihazının özellikleri:
-filtreli fotometre değil, spektrofotometre olmalı.
-Okuma aralığı 340-700 nm aralığını kapsamalıdır.
-Cihazın küvet okuma kısmı ısıtıcılı olmalıdır.
-Optik okuma için gerek duyduğu asgari reaksiyon hacmi küçük olmalıdır.
-Cihaz gerekli program bilgilerini hafızasında tutabilmelidir.
-Şebeke elektrik akımındaki dalgalanmaların zararlı etkilerinden korunmak için bir regülatörü olmalıdır.
-Çift ışık yollu cihaz olmalıdır.
-Dijital göstergeli ve 0 100 ayarlarını otomatik yapmalıdır.
-Hafıza sistemi açık olmalıdır; test parametreleri kullanıcı tarafından değiştirilebilmelidir.
-Bikromatik (çift dalga boylu) okuma yapabilmelidir.
-Dalga boyu geçişleri kesintisiz olmalıdır; her bir nm dalga boyuna ayarlanabilmelidir.
-Cihaz, non-lineer testleri çalışıp hesaplayabilmelidir.
Spektrofotometrelerin kalibrasyonu:
-Bir miktar potasyum bikromat (K2Cr2O7), 100oC’de bir saat süre ile kurutulur.
-Kurutulmuş potasyum bikromattan çok hassas olarak
0,005 g tartılır ve 1 L’lik balon jojede 0,005 M sülfürik asit çözeltisinde son hacim 1 L olacak şekilde çözülür.
-Bu çözeltinin absorbansı, 15-25oC aralığında 1 cm’lik küvette 350 nm dalga boyunda okunur. Reaktif körü olarak 0,005 M sülfürik asit çözeltisi kullanılır.
-Bu şartlarda ölçülen absorbans değeri 0,536±0,005 olmalıdır.
Otomatik bir spektrofotometre, otoanalizördür.
Otoanalizör, numune ve reaktifleri uygun ölçülerde alıp karıştırır, belirli süre ve ısıda inkübe eder, gerekli sürelerde optik okumaları yapıp sonunda ilgili analiz sonucunu hesaplanmış olarak kullanıcıya sunar.
Türbidimetri ve Nefelometri
Bulanıklığın ölçümü esasına dayanan yöntemlerdir.
Türbidimetride, çözeltiye gelen ışık şiddetinde çözeltideki partiküllerin neden olduğu saçılmadan dolayı ortaya çıkan ışık kaybı ölçülür. Bunun için, absorpsiyonun olmadığı dalga boyundaki ışık ve fotometreler veya kolorimetreler kullanılır.
Türbidimetri, genellikle numunedeki protein yapısındaki maddelerin ölçümünde kullanılır. Değişik yöntemlerde proteinler denatüre edilerek çözünürlükleri ortadan kaldırılır; bulanıklık oluşturulur ve bu ölçülür. Antikorların kullanıldığı deneylere immünotürbidimetri adı verilir.
Nefelometride, çözeltideki partiküllerce geliş eksenine göre 90o açıyla yerleştirilmiş olan fotosele doğru saptırılan ışınlar ölçülür. Çeşitli açılarda saçılan ışınları ölçen farklı tip nefelometreler vardır;
spektrofotometreler nefelometri için kullanılamaz.
UV SPEKTROMETRESİ
